IPTG即用型溶液

● 產(chǎn)品簡介：

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ⁺細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃倒置培養(yǎng)12-16hr后，含有插入片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落，而沒有插入片段的質(zhì)粒細(xì)菌形成藍色菌落。

該溶液為50mg/ml （0.2 M）IPTG 的水溶液，已經(jīng)過濾除菌，可以直接使用。除用于細(xì)菌的藍白篩選外，該溶液也可用于誘導(dǎo)蛋白的表達等實驗。

● 藍白篩選實驗程序：

1 轉(zhuǎn)化平板的制備：

向鋪好的含有相應(yīng)抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal(20 mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。

2 轉(zhuǎn)化

          i.    取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μl感受態(tài)細(xì)胞中（感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30分鐘。

         ii.    將離心管置于精確42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不要搖動離心管。

        iii.    向離心管中加入250-500 μl37℃預(yù)熱的SOC或LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150rpm，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。此步目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達，使菌體復(fù)蘇。

        iv.    將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。

3 檢測

將得到的白色菌落接種1-5 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

X-gal/IPTG發(fā)表文章列表：

1. [2022 IF=2.7] Functional verification of the JmLFY gene associated with the flowering of Juglans mandshurica Maxim..

Author: Jiayou Cai, Ruoxue Jia, Ying Jiang, Jingqi Fu, Tianyi Dong, Jifeng Deng, Lijie Zhang.

Journal: Peer J Published March 7, 2023

Institution: Shenyang Agricultural University

Paper link：https://doi.org/10.7717/peerj.14938